Ni Tanrose 6FF（NTA）親和介質(zhì)是將金屬離子Ni2+螯合在以氨三乙酸（NTA）為配基的瓊脂糖凝膠上形成的親和層析介質(zhì)，較 IDA 結(jié)合Ni2+牢固一些。具有吸附量大、選擇好、易于再生、成本低等特點，廣泛用于生物制藥和生物工程下游蛋白質(zhì)和多肽的分離純化，尤其是組氨酸標簽蛋白質(zhì)的高效純化。

Ni Tanrose 6FF（IDA）親和介質(zhì)是將金屬離子Ni2+螯合在以亞氨基二乙酸（IDA）為配基的瓊脂糖凝膠上形成的親和層析介質(zhì)，是一種非常悠久的Ni2+親和填料，由于Ni2+與配基鰲合鍵較少，容易受到小分子的攻擊而使Ni2+容易脫落，但其載量也相對較高。

以下是使用NTA/IDA填料可能會出現(xiàn)的問題及解決方法：

01 通過His標簽純化的蛋白，雜質(zhì)比較多應當怎么做？

①可能原因：蛋白酶會降解部分目的蛋白。

解決方法：加入多種蛋白酶抑制劑改進。

②可能原因：雜質(zhì)蛋白與鎳柱親和力強。

解決方法：可提高雜質(zhì)蛋白與鎳柱結(jié)合起始咪唑濃度。

③可能原因：雜蛋白和目的蛋白結(jié)合。

解決方法：可通過超聲前加入去垢劑或者還原劑消除（1%-2% Triton X-100）。

④可能原因：洗滌不充分。

解決方法：增加洗滌的次數(shù)，充分洗滌。

02 標簽蛋白不與金屬螯合親和層析柱結(jié)合應當怎么做？

①可能原因：超聲的功率不對（功率太大會導致蛋白炭化，功率太小會導致蛋白沒有釋放）。

解決方法：改變超聲功率或超聲前嘗試添加溶菌酶增加細胞破碎率。

②可能原因：組氨酸標簽暴露不完Q。

解決方法：在變性條件下（4-8M脲或4-6M鹽酸胍）進行純化，此時Ni-6FF（IDA）中鎳離子容易脫落，可選擇耐受變性劑的螯合填料，如月旭科技的親和填料Ni Tanrose 6FF（NTA）。

③可能原因：His標簽丟失。

解決方法：WB檢查His-tag是否表達，上游構(gòu)建，改變His-tag的位置（C-端或N-端），必要時增加標簽個數(shù)；孵育的時間不夠，降低流速和增加孵育的時間。

03 用幾次后鎳柱載量下降、掛柱效率低，應該怎么做？

可能原因：

逐漸積累沉淀，變性或非特異結(jié)合的蛋白占據(jù)了有效的結(jié)合位點，并且通過洗脫液無法*清洗所致。

解決方法：

較溫和的清洗方式：用2倍柱體積的6M鹽酸胍或8M尿素洗滌，然后用5倍體積的緩沖液洗滌，以去除沉淀或變性物質(zhì)，接著用2倍柱體積的1% Triton X-100洗滌，然后用5倍柱體積的緩沖液洗滌，以去除疏水結(jié)合的物質(zhì)。若改變不明顯，可選擇強烈清洗方式。

強烈清洗方式：首先用5-10倍柱體積的脫鎳緩沖液（20 mM 磷酸鈉，0.5 M NaCl,，50 mM EDTA，pH 7.4）洗滌，進行脫鎳操作，然后用5-10倍柱體積的平衡緩沖液沖洗，最后用5-10倍柱體積的雙蒸水沖洗；隨后進行清洗操作，去除離子型雜蛋白，可以用5倍柱體積的1.5M NaCl溶液，然后10倍柱體積的雙蒸水沖洗；去除沉淀或變性蛋白，可以用1M氫氧化鈉溶液，結(jié)合1-2小時，然后用10倍柱體積的平衡緩沖液和10倍柱體積的雙蒸水迚行沖洗；去除疏水蛋白或者脂蛋白，可以用5-10倍柱體積的30%異丙醇溶液清洗，然后10倍柱體積的雙蒸水洗滌；最后進行生鎳操作，用0.1M硫酸鎳上柱，隨后5倍柱體積的雙蒸水和平衡緩沖液迚行洗滌。如需保存，保存在20%乙醇溶液。

04 簽蛋白結(jié)合在填料上洗脫不下來，應該怎么做？

①可能原因：洗脫條件太溫和（標簽蛋白仍然結(jié)合在柱上，結(jié)合力較強）。

解決方法：增加咪唑的梯度洗脫或降低pH 來找出最佳的洗脫條件。

②可能原因：降低pH的方法洗脫，若pH低于3.5，會導致鎳離子脫落。

解決方法：改變洗脫辦法，如咪唑競爭性洗脫。

③可能原因：蛋白已沉淀在柱上。

解決方法：1.減少上樣量，或使用咪唑的線性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去污劑或改變NaCl的濃度，或在變性條件（去折疊）下洗脫（用4-8 M脲，或4-6 M鹽酸胍）；2.蛋白在柱上變性固化，用0.5M氫氧化鈉洗柱。

④可能原因：非特異性疏水或其他相互作用。

解決方法：加非離子去污劑到洗脫緩沖液（如：2% Triton X-100）或增加NaCl的濃度。

⑤可能原因：在填料表面形成高密度融合蛋白的聚集。

解決方法：選擇合適載量的填料，切勿一味追求高載量。

05 柱使用過程中發(fā)現(xiàn)堵塞嚴重，且流速越來越慢應該怎么做？

可能原因：

樣品中細胞碎片或其他雜顆粒所致。

解決方法：

樣品處理過程中，高速離心，推薦用0.45um的濾膜過濾。如果柱子堵塞嚴重，重生時使用1% Triton X-100/PBS浸泡過夜。流速慢，可在柱子下面接一根軟管。

06 鎳柱使用過程中出現(xiàn)棕色應該怎么做？

可能原因：

緩沖液中DTT的影響，DTT會對鎳柱的顏色和純化效率有很大的影響，在堿性的緩沖液條件下，鎳離子會被DTT還原生成棕色的沉淀，所以要盡量避免DTT的參與。

解決方法：

若樣品中含有DTT，在上樣之前, 我們推薦采用不含還原性試劑的空白運行來除去任何較弱結(jié)合的鎳離子。

空白運行方法（使用不含還原劑的平衡液和洗脫液）：

1）5倍柱體積的雙蒸水洗柱；

2）5倍柱體積的平衡液洗柱；

3）5倍柱體積的洗脫液洗柱；

4）10倍柱體積的平衡液平衡。

當不使用時，勿將Ni Tanrose 6FF（IDA）保存于含還原性試劑的緩沖液中。