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液相色譜中分離度變差該怎么辦?

更新時間:2022-10-20 點擊次數:5449

相信很多小伙伴都遇到過這類情況,色譜柱使用一段時間后相鄰色譜峰分離度變差,峰形也變寬,或者在做方法開發時,目標物分離度不好。導致這類情況的原因有哪些?遇到問題后該如何排查?今天就和小伙伴們討論交流一下。


在液相色譜中,分離度Rs是色譜分離之中最重要的部分,不管色譜最終的目的是定量定性分析還是樣品制備,都是在一定的分離度基礎上來實現的。分離度計算公式如下:

微信截圖_20221020134435.png

其中,Rs表示分離度,tR2表示相鄰峰中后一個峰的保留時間,tR1表示相鄰峰中前一個峰的保留時間,W1和W2是兩個峰在基線處的峰寬W。

微信截圖_20221020134445.png

色譜峰的保留時間相差越大,或者峰形越窄,就能得到更好的分離結果(分離度增加)。對于色譜分離來說,基線分離有助于獲得準確的定量分析結果。兩個大小接近的色譜峰,基線分離對應Rs>1.5。

成分離度下降的主要原因有哪些?

從分離度的計算公式可以看出,造成分離度下降最直觀的原因有:峰形變寬、拖尾或前延,保留時間發生變化。所以,導致分離度降低的主要原因有:

1. 色譜柱使用時間太長,柱效下降了;

2. 色譜柱或者保護柱或者系統有污染;

3. 樣品被污染變質,導致峰形變寬、拖尾或前延,或出現雜峰干擾;

4. 儀器柱外死體積過大(管路太長,管路內徑太大,檢測器流通池體積過大等),導致柱效降低,峰形變寬;

5. 柱溫的影響。

分離度降低了,該如何解決?

如果是在日常實驗中,碰到分離度降低的情況,首先要排查色譜柱(包括保護柱)是否有污染或者失效,對其進行清洗或更換;其次是要排查樣品污染的問題,重新配制樣品進行分析;最后排查系統污染和流動相污染的問題,清洗儀器管路,更換在線過濾器并更換流動相。排除上述幾種可能性,基本就能解決分離度降低的問題。

如果在方法開發過程中遇到分離度低的情形時,影響因素就有很多了,比如色譜柱類型、填料粒徑、有機相的種類和比例、緩沖鹽的類型和濃度、柱溫、色譜柱的長度等。具體的影響以后會再和大家一一討論。


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